，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄
，不可保存
。
2． 實驗中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存
，以免變質(zhì)
。
3． 不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用
。保質(zhì)前使用。
4． 使用一次性的吸頭以免交叉污染
，吸取終止液和底物A
、B液時
，避免使用帶金屬部分的加樣器。
5． 使用干凈的塑料容器配置洗滌液
。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
6． 洗滌酶標(biāo)板時應(yīng)充分拍干
，不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水
。
7． 底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長時間打開蓋子
。底物B對光敏感
，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸
，有毒。實驗完成后應(yīng)立即讀取OD值
。
8． 加入試劑的順序應(yīng)一致
，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣。
9． 按照說明書中標(biāo)明的時間
、加液的量及順序進行溫育操作
。
樣品收集
、處理及保存方法
1、 血清-----操作過程中避免任何細胞刺激
。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管
。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離
。
2
、 血漿-----EDTA、檸檬酸鹽
、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒
。
3
、 細胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4
、 保存------如果樣品不立即使用
，應(yīng)將其分成小部分-70 ℃保存，避免反復(fù)冷凍
。盡可能的不要使用溶血或高血脂血
。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾
。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍
。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
試劑的準(zhǔn)備
1． 標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋應(yīng)在實驗時準(zhǔn)備
，不能儲存
。稀釋前將標(biāo)準(zhǔn)品振蕩混勻
。稀釋比例按下表中進行：
800 pg/ml （6號標(biāo)準(zhǔn)品） 原倍濃度不用稀釋直接加入50ul
。
400 pg/ml （5號標(biāo)準(zhǔn)品） 100ul的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
200 pg/ml （4號標(biāo)準(zhǔn)品） 100ul的5號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
100 pg/ml （3號標(biāo)準(zhǔn)品） 100ul的4號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
50 pg/ml （2號標(biāo)準(zhǔn)品） 100ul的3號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
25 pg/ml （1號標(biāo)準(zhǔn)品） 100ul的2號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
0 pg/ml （空白對照） 原始濃度不用稀釋直接加入50ul。
2． 洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋
。
操作步驟
1． 使用前
，將所有試劑充分混勻
。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫
，以免加樣時加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差
。
2． 根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)
。每個標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔
。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定
，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。
3． 加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔
、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)
。立即加入50ul的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板
，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時
。
4． 甩去孔內(nèi)液體
，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒
，甩去洗滌液
，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次
。如果用洗板機洗滌
，洗滌次數(shù)增加一次
。
5． 每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP
，輕輕振蕩混勻
，37℃溫育30分鐘。
6． 甩去孔內(nèi)液體
，每孔加滿洗滌液
，振蕩30秒，甩去洗滌液
，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次
。如果用洗板機洗滌
，洗滌次數(shù)增加一次。
7． 每孔加入底物A
、B各50ul
，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鐘
。避免光照
。
8． 取出酶標(biāo)板
，迅速加入50ul終止液
，加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果。
9． 在450nm波長處測定各孔的OD值
。
建議使用的實驗方案
標(biāo)準(zhǔn)品濃度（pg/ml）
A 800 800 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
B 400 400 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
C 200 200 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
D 100 100 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
E 50 50 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
F 25 25 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
G 0 0 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
H 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
局限
6號標(biāo)準(zhǔn)品以上的結(jié)果為非線性的
，根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線無法得到的結(jié)果
。
試劑盒性能
1. 靈敏度：zui小的檢測濃度小于1號標(biāo)準(zhǔn)品。稀釋度的線性
。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990
。
2. 特異性：不與其它細胞因子反應(yīng)。
3. 重復(fù)性：板內(nèi)
、板間變異系數(shù)均小于10%
。
結(jié) 果 判 斷 與 分 析
1
、儀器值：于波長450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值
2
、以吸光度OD值為縱坐標(biāo)（Y），相應(yīng)的IL-4標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)（X）
，做得相應(yīng)的曲線
，樣品的IL-4含量可根據(jù)其OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度
。
掃一掃，關(guān)注微信
當(dāng)前位置：