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大鼠 E-選擇素（E-selectin）ELISA 檢測試劑盒說明

更新時間：2010-11-16 | 點擊率：3040

詳細介紹：

大鼠（Rat） E-選擇素（E-selectin）ELISA 檢測試劑盒
本試劑僅供研究使用標本：血清或血漿

試驗原理：
E-selectin試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）.已知E-selectin濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內(nèi)進行檢測

。先將E-selectin和生物素標記的抗體同時溫育

。洗滌后，加入親和素標記過的HRP

。再經(jīng)過溫育和洗滌

，去除未結合的酶結合物，然后加入底物A

、B

，和酶結合物同時作用。產(chǎn)生顏色

。顏色的深淺和樣品中E-selectin的濃度呈比例關系

。

試劑盒內(nèi)容及其配制
試劑盒成份（2-8℃保存） 96孔配置 48孔配置配制
96/48人份酶標板 1塊板（96T）半塊板（48T）即用型
塑料膜板蓋 1塊半塊即用型
標準品：240ng/ml 1瓶（0.6ml） 1瓶（0.3ml）按說明書進行稀稀
空白對照 1瓶（1.0ml） 1瓶（0.5ml）即用型
標準品稀釋緩沖液 1瓶（5ml） 1瓶（2.5ml）即用型
生物素標記的抗E-selectin抗體 1瓶（6ml） 1瓶（3.0ml）即用型
親和鏈酶素-HRP 1瓶（10ml） 1瓶（5.0ml）即用型
洗滌緩沖液 1瓶（20ml） 1瓶（10ml）按說明書進行稀釋
底物A 1瓶（6.0ml） 1瓶（3.0ml）即用型
底物B 1瓶（6.0ml） 1瓶（3.0ml）即用型
終止液 1瓶（6.0ml） 1瓶（3.0ml）即用型

自備材料
1．蒸餾水。
2．加樣器：5ul

、10ul

、50ul、100ul

、200

、500ul、1000ul

。
3．振蕩器及磁力攪拌器等

。

安全性
1．避免直接接觸終止液和底物A、B

。一旦接觸到這些液體

，請盡快用水沖洗。
2．實驗中不要吃喝

、抽煙或使用化妝品

。
3．不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

操作注意事項
1．試劑應按標簽說明書儲存

，使用前恢復到室溫

。稀稀過后的標準品應丟棄，不可保存

。
2．實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中

，密封保存，以免變質

。
3．不用的其它試劑應包裝好或蓋好

。不同批號的試劑不要混用。保質前使用

。
4．使用一次性的吸頭以免交叉污染

，吸取終止液和底物A

、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器

。
5．使用干凈的塑料容器配置洗滌液

。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
6．洗滌酶標板時應充分拍干

，不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水

。
7．底物A應揮發(fā)，避免長時間打開蓋子

。底物B對光敏感

，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸

，有毒

。實驗完成后應立即讀取OD值。
8．加入試劑的順序應一致

，以保證所有反應板孔溫育的時間一樣

。
9．按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作

。

樣品收集

、處理及保存方法
1、血清-----操作過程中避免任何細胞刺激

。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管

。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離

。
2

、血漿-----EDTA、檸檬酸鹽

、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒

。
3

、細胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4

、保存------如果樣品不立即使用

，應將其分成小部分-70 ℃保存，避免反復冷凍

。盡可能的不要使用溶血或高血脂血

。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾

。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍

。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍

。

試劑的準備
1．標準品：標準品的系列稀釋應在實驗時準備，不能儲存

。稀釋前將標準品振蕩混勻

。稀釋比例按下表中進行：
240 ng/ml （6號標準品）原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。
120 ng/ml （5號標準品） 100ul的原倍標準品加入100ul的標準品稀釋液
60 ng/ml （4號標準品） 100ul的5號標準品加入100ul的標準品稀釋液
30 ng/ml （3號標準品） 100ul的4號標準品加入100ul的標準品稀釋液
15 ng/ml （2號標準品） 100ul的3號標準品加入100ul的標準品稀釋液
7.5 ng/ml （1號標準品） 100ul的2號標準品加入100ul的標準品稀釋液
0 ng/ml （空白對照）原始濃度不用稀釋直接加入50ul

。

2．洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋

。

操作步驟
1．使用前，將所有試劑充分混勻

。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫

，以免加樣時加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差

。
2．根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)

。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定

，能使用復孔的盡量做復孔

。
3．加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔、加入待測樣品50ul于反應孔內(nèi)

。立即加入50ul的生物素標記的抗體

。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻

，37℃溫育1小時

。
4．甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液

，振蕩30秒

，甩去洗滌液，用吸水紙拍干

。重復此操作3次

。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次

。
5．每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP

，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘

。
6．甩去孔內(nèi)液體

，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒

，甩去洗滌液

，用吸水紙拍干。重復此操作3次

。如果用洗板機洗滌

，洗滌次數(shù)增加一次

。
7．每孔加入底物A、B各50ul

，輕輕振蕩混勻

，37℃溫育10分鐘。避免光照

。
8．取出酶標板

，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應立即測定結果

。
9．在450nm波長處測定各孔的OD值

。

建議使用的實驗方案
標準品濃度（ng/ml）
A 240 240 樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品
B 120 120 樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品
C 60 60 樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品
D 30 30 樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品
E 15 15 樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品
F 7.5 7.5 樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品
G 0 0 樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品
H 樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品

局限
6號標準品以上的結果為非線性的，根據(jù)此標準曲線無法得到的結果

。

試劑盒性能
1. 靈敏度：zui小的檢測濃度小于1號標準品

。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預期濃度相關系數(shù)R值為0.990

。
2. 特異性：不與其它細胞因子反應

。
3. 重復性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%

。

結果判斷與分析
1

、儀器值：于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值

2、以吸光度OD值為縱坐標（Y）

，相應的E-selectin標準品濃度為橫坐標（X）

，做得相應的曲線，樣品的E-selectin含量可根據(jù)其OD值由標準曲線換算出相應的濃度